Биология богатой тромбоцитами плазмы и ее клиническое применение при восстановлении хряща

Аннотация

Обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) — это аутологичный концентрированный коктейль из факторов роста и медиаторов воспаления, который считается потенциально эффективным для восстановления хрящевой ткани. Кроме того, фибриноген в PRP может активироваться и образовывать фибриновый матрикс для заполнения повреждений хрящевой ткани, удовлетворяя начальные требования физиологического заживления ран. В этой статье рассматриваются анаболические, противовоспалительные и каркасные эффекты PRP, основанные на лабораторных исследованиях, экспериментах на животных и клинических испытаниях. В лабораторных условиях было обнаружено, что PRP стимулирует пролиферацию клеток и выработку хрящевого матрикса хондроцитами и взрослыми мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), усиливает секрецию матрикса синовиоцитами, ослабляет воспаление, вызванное IL-1β, и обеспечивает благоприятную среду для МСК. В доклинических исследованиях PRP использовалась либо в качестве геля для заполнения дефектов хрящевой ткани с переменным успехом, либо для замедления прогрессирования артрита на животных моделях с положительными результатами. Результаты текущих клинических исследований показывают, что PRP может заполнять дефекты хрящевой ткани, ускоряя ее восстановление, ослабляя симптомы остеоартрита и улучшая функцию суставов, при этом обладая приемлемым профилем безопасности. Несмотря на то, что современные данные свидетельствуют в пользу PRP, а не гиалуроновой кислоты при лечении остеоартрита, эффективность PRP-терапии остается непредсказуемой из-за крайне неоднородного характера проведенных исследований и изменчивого состава препаратов PRP. Будущие исследования имеют решающее значение для выяснения функциональной активности отдельных компонентов PRP в модулировании конкретных патогенных механизмов.

Введение

Повреждения хрящевой ткани являются распространенной клинической проблемой и затрагивают 27 миллионов человек в США, что приводит к 208 600 первичным операциям по тотальному эндопротезированию тазобедренного сустава и 450 000 первичным операциям по тотальному эндопротезированию коленного сустава, согласно данным за 2005 год. Ожидается, что к 2030 году количество операций по тотальному эндопротезированию тазобедренного сустава и коленного сустава достигнет 572 000 и 3 480 000 соответственно.

В последнее десятилетие обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) стала применяться в качестве безоперационного метода лечения повреждений хрящевой ткани. Обоснование ее использования во многом зависит от ее функциональных компонентов (рис. 1). Несмотря на значительные различия в составе, исходная PRP всегда содержит большое количество тромбоцитов и ряд белков плазмы, связанных с тромбоцитами, во время ее приготовления путем центрифугирования.

Тромбоциты образуются из мегакариоцитов в виде безъядерных клеток. В тромбоцитах хранятся различные факторы роста, факторы свертывания крови, молекулы адгезии, цитокины, хемокины и интегрины. После активации тромбоциты в PRP могут высвобождать множество факторов роста в концентрациях, значительно превышающих базовый уровень в крови, включая трансформирующий фактор роста-β, фактор роста тромбоцитов (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), основные факторы роста фибробластов, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), факторы роста эпидермиса и многие другие. Многие из этих анаболических цитокинов, такие как трансформирующий фактор роста-β, инсулиноподобный фактор роста, основной фактор роста фибробластов и PDGF, способствуют развитию хрящевой ткани и защищают ее. В частности, они могут стимулировать пролиферацию хондроцитов и мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), способствовать синтезу хондроцитами аггрекана и коллагена II типа (Col II), стимулировать хондрогенную дифференцировку МСК, предотвращать апоптоз хондроцитов и МСК и уменьшать катаболическое действие воспалительных цитокинов, таких как IL-1β, и матриксных металлопротеиназ (ММП).

Тромбоциты в PRP также являются источником медиаторов воспаления и модуляторов. После инкубации с полиакриламидными шариками тромбоциты могут высвобождать множество противовоспалительных цитокинов, включая антагонист рецептора IL-1 (IL-1ra), растворимый рецептор фактора некроза опухоли (TNF) (sTNF-R) I и II, IL-4, IL-10, IL-13 и интерферон γ. В частности, IL-1ra подавляет биологическую активность IL-1, блокируя его рецепторы. sTNF-RI и sTNF-RII могут связываться с свободным TNFα, тем самым предотвращая передачу сигнала. IL-4, IL-10 и IL-13 могут повышать выработку IL-1ra и снижать выработку простагландина E2, вызванную TNFα. Интерферон γ индуцирует выработку связывающего IL-18 белка, естественного ингибитора IL-18. Хотя PRP также высвобождает провоспалительные цитокины, такие как IL-1α, IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8, IL-17 и IL-18, их концентрация намного ниже, чем у противовоспалительных цитокинов. Например, концентрация IL-1ra в PRP более чем в 23 000 раз выше, чем концентрация IL-1α, и более чем в 8000 раз выше, чем концентрация IL-1β. Значительная разница между концентрациями противовоспалительных цитокинов и провоспалительных факторов в PRP позволяет предположить, что PRP может подавлять воспаление при остеоартрите (ОА), тем самым защищая хрящи и уменьшая боль.

PRP также содержит различные белки плазмы, которые, как известно, являются важнейшими компонентами механизма заживления соединительных тканей. В отличие от сыворотки, плазма содержит фибриноген и другие факторы свертывания, которые могут активироваться для формирования временного фибринового каркаса, позволяющего клеткам прикрепляться, мигрировать и размножаться. Поскольку во время свертывания тромбоциты агрегатируются вдоль фибриновых волокон, полученный трехмерный каркас также может служить резервуаром факторов роста, оказывающих благоприятное воздействие на клетки. Клинические преимущества фибринового матрикса PRP хорошо известны в челюстно-лицевой хирургии и при лечении хронических ран. Поскольку суставной хрящ не содержит кровеносных сосудов и, следовательно, не может инициировать процесс заживления, как другие ткани с хорошим регенеративным потенциалом, введение каркаса из PRP может имитировать начальную стадию заживления ран и восстановления тканей.

Основываясь на потенциальной пользе входящих в его состав биологических факторов, была выдвинута гипотеза о том, что PRP или его производные могут оказывать положительное влияние на восстановление хрящевой ткани. Поскольку в литературе имеются обширные обзоры, посвященные конкретным факторам роста, в этом обзоре основное внимание будет уделено совокупному воздействию PRP на клетки, в том числе хондроциты, МСК из различных тканей и синовиоциты, а также на повреждение хрящевой ткани в лабораторных моделях на животных, в том числе на лошадях, и на заболевания хрящевой ткани у людей. Чтобы обеспечить точный обзор, здесь используется система классификации, предложенная Доаном и его коллегами, для разделения общего PRP на чистый PRP (P-PRP), лейкоцитарный PRP (L-PRP), чистый фибрин, богатый тромбоцитами, и лейкоцитарный фибрин, богатый тромбоцитами (L-PRF), если доступна соответствующая информация.

Влияние богатой тромбоцитами плазмы на клетки

Хондроциты

Пролиферация

Почти во всех опубликованных исследованиях было показано, что PRP оказывает сильное положительное влияние на пролиферацию хондроцитов in vitro. Когда хондроциты взрослых свиней культивировали в альгинатных шариках в присутствии 10% высвобождаемого фактора роста тромбоцитов (PRP), 10% высвобождаемого фактора роста тромбоцитов, обедненного тромбоцитами (PPP), или 10% бычьей сыворотки (FBS) в течение 72 часов, увеличение содержания ДНК в группе PRP было значительно выше, чем в группе PPP и в группе FBS. Стимулирующее действие PRP на пролиферацию хондроцитов также наблюдалось после 4, 8 и 12 дней культивирования in vitro в монослойной или трехмерной среде. Дополнительные исследования показали, что PRP усиливает пролиферацию хондроцитов в зависимости от дозы и времени даже в течение 20-дневной монослойной культуры.

Дифференцировка

Однако влияние PRP на дифференцировку хондроцитов менее выражено. Акеда и его коллеги сообщили, что обработка 10%-ным раствором PRP значительно увеличивает синтез протеогликанов и коллагена II по сравнению с обработкой 10%-ным раствором PPP или 10%-ным раствором FBS. При этом основные профили протеогликанов и коллагена были такими же, как у клеток, культивируемых в FBS, что указывает на сохранение стабильного фенотипа хондроцитов при воздействии PRP. Аналогичные эффекты были отмечены и в хондроцитах человека, страдающего остеоартритом. Супернатант из богатого тромбоцитами фибрина (PRF) повышал экспрессию мРНК коллагена II и аггрекана, а также увеличивал синтез гликозаминогликанов и протеогликанов хондроцитами, культивируемыми либо на двумерной поверхности фибриновых каркасов, либо в трехмерных каркасах, по сравнению с контрольными образцами без добавления экссудата. Кроме того, протеомное исследование показало, что добавление PRPr также может вызывать экспрессию белков, связанных с дифференцировкой хондроцитов. В частности, PRPr повышал экспрессию аггрекана и Sox9, не повышая экспрессию Col X и щелочной фосфатазы. Было показано, что повышенная экспрессия Sox9 связана с процессом редифференцировки хондроцитов. Эти результаты показывают, что PRP по-разному влияет на хондроциты, то есть способствует синтезу матрикса гиалинового хряща, в то время как клеточная прогрессия до терминальной гипертрофии не ускоряется или, по крайней мере, замедляется. Другое исследование показало, что хондрогенная дифференцировка и созревание, вызванные лечением PRP, связаны с повышенной экспрессией каннабиноидных рецепторов 1 и 2. Однако некоторые авторы утверждают, что лечение PRP не может вызвать отложение типичных компонентов матрикса хряща, что не было различий в усилении выработки внеклеточного матрикса (ВКМ) между группами с добавлением PRP, PPP, цельной крови или фибринового клея в микроносители на основе желатина, и что лечение PRP на самом деле может вызвать дедифференцировку хондроцитов в направлении фибробластоподобного фенотипа. Такое отсутствие согласованности в опубликованных отчетах может быть связано с неоднородностью дизайна исследований, различиями в подготовке PRP и способах введения PRP. Например, в некоторых исследованиях использовался лизат тромбоцитов, полученный путем многократного замораживания и оттаивания после центрифугирования, в некоторых использовался экссудат после образования сгустка без добавления внешних активаторов, а в других использовался PRPr, полученный после активации тромбином.

Противовоспалительное

Недавно также было доказано, что PRP обладает противовоспалительным действием в условиях остеоартрита. Хондроциты человека, страдающего остеоартритом, культивировали с 10 нг/мл IL-1β, чтобы имитировать условия остеоартрита в среде с 10% PRPr или без него. Через 48 часов IL-1β подавлял экспрессию генов Col II и аггрекана и одновременно повышал экспрессию дезинтегрина и металлопротеиназы с тромбоспондиновыми мотивами-4 и простагландин-эндопероксидазы-2, в то время как добавление PRPr снижало эти эффекты, опосредованные IL-1β. Кроме того, PRP может полностью подавлять вызванную IL-1β активацию ядерного фактора каппа-би (NF-κB), основного механизма, участвующего в патогенезе ОА (P < 0,001). Дальнейшее исследование показало, что PRP подавляет активацию NF-κB за счет увеличения экспрессии генов фактора роста гепатоцитов (HGF) и TNF-α. Было показано, что HGF увеличивает экспрессию ингибитора NF-κB-α, тем самым препятствуя транслокации p65 в ядро, которая необходима для активации NF-κB. TNF-α усиливает образование гомодимера p50 и его связывание с ДНК, чтобы подавить активацию пути NF-κB. Примечательно, что путь NF-κB — не единственный, участвующий в противовоспалительной активности PRP. IGF-1 и PDGF-bb, присутствующие в PRP, также могут подавлять активацию пути Src/PI3K/AKT, тем самым подавляя апоптоз хондроцитов и воспаление, вызванное IL-1β.

Следует также отметить, что некоторые составы PRP могут вызывать воспаление. Наличие концентрированных лейкоцитов повышает уровень катаболических и провоспалительных сигнальных молекул, включая матриксные металлопротеиназы и IL-1β. Кроме того, активированные тромбоциты могут вырабатывать IL-1β для передачи провоспалительных сигналов. Однако наиболее распространенный провоспалительный цитокин IL-1β показал лишь незначительное увеличение после активации тромбоцитов, в то время как противовоспалительные молекулы, такие как IL-4 и IL-10, увеличились более чем в пять раз. Недавнее исследование подтвердило двойственное воздействие лизата тромбоцитов на хондроциты человека: кратковременная провоспалительная активность с последующим разрешением воспаления. Хотя конечные результаты PRP-терапии варьируются в зависимости от состава, противовоспалительный эффект, скорее всего, преобладает в препаратах PRP, в которых содержание лейкоцитов существенно снижено.

Мезенхимальные стволовые клетки взрослых

В качестве клеток-кандидатов, пригодных для тканевой инженерии, направленной на восстановление хрящевой ткани, МСК имеют заметные преимущества перед хондроцитами благодаря своей широкой доступности, высокой хондрогенной активности, сопровождающейся выработкой матрикса хрящевой ткани, и способности к многолинейной дифференцировке для восстановления дефектов остеохондральной ткани.

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга

Среди различных источников МСК наиболее широко используются МСК, полученные из костного мозга (BMSC). Многие исследователи обнаружили, что PRP оказывает митогенный эффект на МСК. При культивировании МСК человека в монослое с 10% инактивированной аутологичной PRP на 7-й день наблюдалось пятикратное увеличение клеточной пролиферации по сравнению с контролем без добавления PRP. В то время как маркеры хондрогенной и остеогенной дифференцировки повышались в присутствии PRP, маркеры хондрогенной дифференцировки, в том числе Sox9 и аггрекан, повышались гораздо сильнее (более чем в 10 раз), чем RUNX2 (менее чем в 2 раза), маркер ранней остеогенной дифференцировки. Авторы пришли к выводу, что PRP может усиливать пролиферацию и хондрогенную дифференцировку МСК. Однако в этом исследовании МСК культивировались всего 7 дней, и долгосрочное воздействие PRP на МСК оставалось неясным. В другом исследовании, где МСК культивировались в течение 21 дня, экспрессия Sox9, аггрекана и коллагена II значительно повысилась как на уровне мРНК, так и на уровне белка в присутствии инактивированного PRP по сравнению с контролем с FBS. Однако экспрессия гена Col I и белка также повышалась под воздействием PRP. Такое неизбирательное повышение экспрессии как хондрогенных, так и остеогенных генов под воздействием PRP в мультипотентных МСК in vitro следует учитывать с осторожностью при инженерии хрящевой ткани, но это может быть полезно и применимо для восстановления дефектов остеохондромы.

Стволовые клетки, полученные из жировой и мышечной тканей, и клетки-предшественники, полученные из субхондральной кости человека

Помимо МСК, полученных из костного мозга, было также предварительно изучено влияние PRP на МСК, полученные из жировой ткани, мышц и субхондральной кости. МСК, полученные из жировой ткани кролика, реагировали на стимуляцию PRP так же, как и МСК, полученные из костного мозга, то есть пролиферация клеток, экспрессия генов и белков Sox9, аггрекана, коллагена I и коллагена II значительно усиливались по сравнению с контролем с FBS. Когда МСК, полученные из мышц, культивировали в присутствии PRP, их способность к пролиферации, адгезии и миграции значительно повышалась. Хотя экспрессия хондрогенных генов не усиливалась, количество клеток, вырабатывающих коллаген II, заметно увеличивалось. В то же время клеточный апоптоз также усиливался in vitro, но in vivo исследование дало противоположные результаты, показав, что апоптоз подавлялся в присутствии PRP. МСК из субхондральной кости считаются основными источниками клеток, отвечающих за восстановление дефектов хряща при клиническом применении микропереломов. Исследование показало, что лечение P-PRP может стимулировать вертикальную миграцию субхондральных клеток-предшественников и накопление хрящевого матрикса, включая протеогликаны и коллаген II. Что еще более важно, в то время как хондрогенная дифференциация клеток-предшественников значительно усиливалась при лечении PRP, остеогенная и адипогенная дифференциация не изменялась. Эти результаты позволяют предположить, что PRP может ускорять миграцию субхондральных клеток-предшественников для восстановления дефектов хряща с образованием гиалинового хряща.

Деятельность по созданию каркасов

Помимо положительного влияния на пролиферацию, дифференцировку и миграцию МСК, PRP может также служить трехмерным субстратом для заселения клеток благодаря наличию фибриногена, который легко превращается в фибриновый гель при активации тромбином или кальцием. В недавнем исследовании около 1 × 105 МСК кролика были смешаны с 60 мкл ультрафильтрованного лизата тромбоцитов, а затем смесь была активирована тромбином и CaCl2 для формирования трехмерного заполненного клетками каркаса с последующим культивированием in vitro в среде для индукции хондрогенеза в течение 21 дня. Через 1 неделю внутри лакун были обнаружены округлые клетки, похожие на хондроциты, которые равномерно распределялись внутри каркаса, а некоторые клетки группировались внутри каркаса. Гистологический анализ через 3 недели подтвердил наличие этих клеток, похожих на хондроциты, и накопление хрящевой внеклеточной матрицы. Однако детали структуры этого каркаса не изучались.

В другом исследовании Кан и его коллеги изучили компоненты и микроструктуру L-PRF, которая естественным образом образуется при одноэтапном центрифугировании цельной крови без антикоагулянтов. Они обнаружили, что в каркасе PRF есть две отдельные зоны: зона тромбоцитов и зона фибрина. Заметным преимуществом L-PRF является простота процедуры и отсутствие дополнительных химических веществ. Тем не менее, препарат PRF может препятствовать равномерному засеву клеток внутри, а его двухзонная микроструктура предполагает возможные значительные колебания в высвобождении факторов роста.

В нашем недавнем исследовании мы использовали традиционный метод двойного центрифугирования для получения жидкой PRP. Затем МСК распределялись в PRP, после чего она активировалась CaCl2 для формирования трехмерного каркаса. Гистологическое исследование и сканирующая электронная микроскопия показали, что матрица PRP имела сотовую микроструктуру с тромбоцитами, сгруппированными вдоль фибринового каркаса, к которому прикреплялись МСК (рис. 2). Другое пилотное исследование показало, что культивирование МСКК лошадей в трехмерном геле PRP в течение 3 недель привело к усилению пролиферации клеток и синтезу протеогликанов по сравнению с клетками, культивированными только в фибриновом геле. Однако, в отличие от L-PRF, и лизат тромбоцитов, и двойной гель PRP, активированный CaCl2, обычно имеют низкую плотность фибрина и слабую полимеризацию и поэтому быстро растворяются, подобно фибриновому клею.

(подпись к рисунку 2) Сканирующая электронная микроскопия матриксов PRP, содержащих МСК. МСК прикрепляются к фибриновым волокнам PRP (места прикрепления указаны стрелками на B). A) при малом увеличении; B) при большом увеличении. МСК — мезенхимальные стволовые клетки; PRP — обогащенная тромбоцитами плазма.

Сообщалось, что коммерчески доступный фибриновый гель разрушается в течение 7 дней, но такую быструю деградацию можно замедлить, засеяв его клетками и добавив ингибиторы фибринолиза, такие как транексамовая кислота, апротинин и галарин. Гель из PRP и транексамовой кислоты, засеянный хондроцитами, может сохранять стабильность in vitro в течение 4 недель без усадки, при этом клетки остаются жизнеспособными и могут мигрировать. Посаженные хондроциты, вероятно, вырабатывали большое количество внеклеточного матрикса, что соответствовало деградации каркаса. Ингибирование деградации фибрина также означало бы более медленное и продолжительное высвобождение факторов роста для достижения лучших результатов восстановления. Низкие механические свойства фибринового каркаса PRP можно улучшить с помощью генпинового сшивания, фотосшивания, катализируемого рутением, или регулируя содержание фибриногена. Оптимизированный фибриновый гель может противостоять динамическому сжатию и сдвигу в месте повреждения ткани, в то время как встроенные хондроциты продолжают вырабатывать когезивный хрящевой внеклеточный матрикс, содержащий протеогликаны и коллаген II. Кроме того, гель PRP можно использовать с другими биоматериалами для улучшения его механических свойств.

Синовиоциты

Внутрисуставное введение PRP также может оказывать влияние на фибробластоподобные синовиоциты, которые могут выделять гиалуроновую кислоту (ГК) и HGF, а также цитокины и матриксные металлопротеиназы, содержащиеся в синовиальной жидкости. Было доказано, что ГК в синовиальной жидкости оказывает положительное влияние на пациентов с артритом, а HGF участвует во многих сигнальных путях и, как было доказано, подавляет активацию NF-κB. С другой стороны, ММП могут способствовать катаболизму хрящевой ткани. Таким образом, влияние PRP на синовиоциты может косвенно влиять на восстановление поврежденного хряща. Синовиоциты пациентов с остеоартритом, культивируемые в 20%-ном однокомпонентном P-PRP, активированном CaCl2, вырабатывали значительно больше гиалуроновой кислоты и HGF по сравнению с теми, которые культивировались в PPP. Повышенная секреция гиалуроновой кислоты, вызванная P-PRP, также наблюдалась в синовиоцитах в присутствии IL-1β, что указывает на то, что PRP может усиливать хондропротекцию и смазку суставов с помощью синовиоцитов даже в условиях воспаления. В синовиоцитах человека, обработанных L-PRP, уровень ММП был значительно выше, чем в необработанных синовиоцитах, но P-PRP не усиливал вызванный IL-1β рост уровня ММП в синовиоцитах пациентов с остеоартритом.

Влияние богатой тромбоцитами плазмы на восстановление хрящевой ткани в моделях на животных in vivo

Модели дефектов хряща

Чтобы выяснить, оказывает ли PRP положительное влияние на хондрогенез in vivo, Ву и его коллеги поместили культивируемые хондроциты в аутологичную PRP, чтобы получить композиты PRP/хондроциты с конечной плотностью клеток 5 × 107/мл. Композиты активировали тромбином перед введением в подкожную ткань спины кроликов-доноров. Через 2 месяца под кожей образовались твердые пальпируемые узелки, и магнитно-резонансная томография (МРТ) показала наличие хрящевой ткани. Окрашивание сафранином-О и трихромное гистологическое окрашивание по Массону показали наличие протеогликанов и коллагена. Хотя тип вновь образованного коллагена не был определен, эти результаты позволяют предположить, что PRP можно использовать в качестве клеточного каркаса при инженерии хрящевой ткани. В другом исследовании PRP использовалась в качестве биоактивного каркаса отдельно или в сочетании с МСК для заполнения остеохондральных дефектов (4 мм в диаметре, 3 мм в глубину) в бедренно-надколенниковой борозде у кроликов. Через 12 недель после имплантации только PRP-матрикс показал лучшие макроскопические, гистологические и иммунологические результаты, чем в контрольной группе, но худшие, чем в группе PRP-МСК. Иммуногистологическое и молекулярное исследование показало наличие коллагена II в регенерированной ткани в группе PRP-матрикса и более обильное накопление коллагена II в группе PRP-МСК. В связи с низкими механическими свойствами PRP Сан и его коллеги использовали PRP в качестве добавки к каркасам из поли (молочной и гликолевой кислоты) (PLGA) для восстановления крупных дефектов остеохондроса (5 мм в диаметре, 4 мм в глубину) у кроликов. Через 4 и 12 недель по сравнению с PLGA PRP увеличил содержание хрящевой внеклеточной матрицы и улучшил формирование субхондральной кости. Эти результаты согласуются с результатами предыдущего исследования, в котором для восстановления дефектов остеохондропластического типа (4 мм в диаметре, 3 мм в глубину) у кроликов использовался двухслойный коллагеновый каркас с PRP или без него.

Однако положительное влияние PRP на регенерацию хрящевой ткани у кроликов не удалось последовательно подтвердить на более крупных животных, в том числе на овцах и козах. На модели овцы в мыщелках бедренной кости были созданы дефекты остеохондральной ткани (7 мм в диаметре, 9 мм в глубину), которые затем были заполнены коллагеново-гидроксиапатитовым каркасом отдельно или в сочетании с L-PRP. Хотя через 6 месяцев в обеих группах лечения была достигнута хорошая интеграция хондральной поверхности, в группе, получавшей PRP, наблюдалось неполное формирование кости и неравномерная интеграция поверхности хряща, в то время как в группе, получавшей только каркас, наблюдалась значительно более эффективная остеохондральная реконструкция. Другое исследование с использованием модели остеохондрального дефекта у коз (6 мм в диаметре, 0,8 мм в глубину) также подтвердило ингибирующее воздействие добавления L-PRP на восстановление хряща. Тем не менее, согласно исследованию Милано и коллег Повторные внутрисуставные инъекции P-PRP на модели хряща овцы (8 мм в диаметре, только хрящ) значительно улучшили макроскопические, гистологические и биомеханические результаты вновь регенерированной ткани по сравнению с группой без инъекций PRP. Кроме того, репаративный ответ после инъекций P-PRP был более длительным и стабильным в течение 12-месячного периода наблюдения. Их более позднее исследование показало, что стабилизация P-PRP в дефектах хряща с помощью фибринового клея привела к более высоким результатам гистологической и механической оценки, чем внутрисуставные инъекции PRP, но ни один из этих методов не привел к регенерации гиалинового хряща. Эти противоречивые результаты свидетельствуют о негативном влиянии концентрированных лейкоцитов в составе PRP на восстановление хряща.

Модели артрита

В модели травматического остеоартрита у кроликов, вызванного односторонним рассечением передней крестообразной связки, 33 кроликам вводили инъекции фосфатно-солевого буфера (PBS), инъекции микросфер, содержащих PBS, инъекции PRPr после активации тромбином и CaCl2 или инъекции микросфер, содержащих PRPr, в пораженные коленные суставы. Инъекции проводились дважды с интервалом в 3 недели. Через десять недель серьезные изменения при остеоартрите (эрозия субхондральной кости) наблюдались в 25% случаев в группе PBS, в 33% случаев в группе PBS-микросфер и в 25% случаев в группе PRPr, но ни в одном из суставов в группах PRPr-микросфер не было выявлено серьезных изменений при остеоартрите. Это открытие позволяет предположить, что длительное высвобождение PRPr оказывает сдерживающее влияние на прогрессирование травматического остеоартрита. Влияние PRP на уже существующий прогрессирующий остеоартрит требует дальнейшего изучения. В нетравматической модели остеоартрита у кроликов, вызванной двукратными внутрисуставными инъекциями коллагеназы II типа, через 4 недели была введена однократная инъекция PRP, а в качестве контроля использовалась инъекция физиологического раствора. Четыре недели спустя в коленях, в которые вводили PRP, наблюдалось значительное снижение макроскопических и гистологических показателей дегенерации хряща по сравнению с контрольной группой. Это позволяет предположить, что PRP может подавлять катаболический эффект коллагеназы или усиливать анаболическую реакцию поврежденного хряща. Однако ни в одном из вышеупомянутых исследований не изучались изменения в медиаторах воспаления. PRP также тестировали для лечения ревматоидного артрита суставов. На модели свиньи вводили бычий сывороточный альбумин, чтобы вызвать артрит в обоих коленях. Аутологичную PRP вводили в правое колено через 2 недели и 4 недели, а в левое колено в качестве контрольной группы вводили физраствор. Через 2 недели после второй инъекции PRP значительно уменьшила снижение содержания протеогликанов и коллагена II в хряще, повышение уровня IL-6 и VEGF, а также повышение концентрации белков IL-1β, IL-6, VEGF и IGF-1 в синовиальной оболочке и хряще по сравнению с контрольной группой. Эти результаты не только показали, что PRP может быть альтернативным методом лечения острого ревматоидного артрита, но и подтвердили, что PRP оказывает противовоспалительное действие при артрите суставов.

Артрит лошадей

Одним из ключевых ограничений современных моделей артрита является то, что патология хрящевой ткани создается искусственно, а не в результате естественных заболеваний, что может поставить под сомнение целесообразность клинического применения PRP. В отчете Кармоны и коллег семь лошадей с тяжелыми заболеваниями суставов (у четырех был остеоартрит, у трех — остеохондроз) прошли курс из трех внутрисуставных инъекций PRP с интервалом в 2 недели после того, как другие консервативные методы или артроскопические вмешательства не помогли. Через два месяца после последней инъекции объем синовиальной жидкости и степень хромоты у всех семи лошадей значительно уменьшились (P < 0,05), и тенденция к облегчению симптомов сохранялась в течение года наблюдения. Однако в этом исследовании не отслеживались изменения в хрящевой ткани.

Влияние богатой тромбоцитами плазмы на повреждение хряща человека

В зависимости от убедительности доказательств, опубликованные в настоящее время отчеты о лечении дегенеративных заболеваний хрящевой ткани с помощью PRP можно разделить на следующие четыре уровня: уровень IV — серии случаев; уровень III — ретроспективные сравнительные исследования; уровень II — проспективные сравнительные исследования или менее качественные рандомизированные контролируемые исследования (РКИ); уровень I — высококачественные РКИ.

Очаговые поражения хряща

Было опубликовано лишь несколько отчетов о лечении очаговых дефектов хряща с помощью PRP, и все они представляют собой описания клинических случаев с небольшим количеством пациентов и краткосрочными результатами. Таким образом, представлены лишь слабые доказательства.

В одном из отчетов о клинических случаях описывается 12-летний футболист, у которого был диагностирован крупный (более 2 см2) свободный хондральный отломок, оторвавшийся от медиального мыщелка бедренной кости. После того как свободный отломок был помещен на свое место, для устранения несоответствия между кратером и фрагментом во время артроскопической операции была введена активированная CaCl2 P-PRP. Учитывая крайне неблагоприятный прогноз при более обширном отрыве хряща, который не распространялся на васкуляризированную субхондральную кость, такое лечение считалось очень успешным, поскольку пациент вернулся к участию в футбольных соревнованиях без каких-либо симптомов через 38 недель после операции. Авторы объяснили успех добавлением PRP, которая способствовала восстановлению хрящевого фрагмента.

Поскольку МСК играют важнейшую роль в инженерии хрящевой ткани, Халим и его коллеги поместили расширенные аутологичные МСК в гель PRP для заполнения дефектов хрящевой ткани в мыщелках бедренной кости. В исследование были включены пять пациентов в возрасте от 21 до 37 лет с дефектами площадью от 3 до 12 см2. Симптомы у всех пациентов улучшились в течение 12 месяцев наблюдения. Средние показатели по шкале Лисхольма и пересмотренной шкале Hospital for Special Surgery Knee показали статистически значимое улучшение (P < 0,05). Показатели артроскопии, рекомендованные Международным обществом по восстановлению хрящевой ткани, были почти нормальными у двух пациентов, согласившихся на повторную артроскопию. МРТ у трех пациентов показала полное заполнение дефекта и соответствие поверхности естественному хрящу.

Учитывая потенциальные риски, связанные с культивированием МСК в лабораторных условиях, некоторые авторы склоняются к использованию микрофрактурирования или концентрата костного мозга для введения МСК в дефекты. Дхолланднер и его коллеги сообщили о пяти пациентах, которым была проведена микрофрактуризация и заполнение дефектов надколенника гелем L-PRP площадью от 1 до 3 см2. Дефекты были закрыты мембранами Col I/III. Симптомы и функции колена у всех пяти пациентов значительно улучшились после операции. Однако такие благоприятные результаты не были подтверждены данными МРТ, которые показали изменения субхондральной пластинки и костной ткани во всех пяти случаях, а также внутрисуставные остеофиты в трех случаях через 2 года после операции. В другой серии из 20 пациентов в остеохондральные дефекты мыщелка бедренной кости был имплантирован композит из мембраны гиалуроновой кислоты, концентрата костного мозга и геля P-PRP. За 29 месяцев наблюдения баллы Международного комитета по документации коленного сустава (IKDC) улучшились с 32,9 до 90,4 (P < 0,0005), а баллы по исходам травмы коленного сустава и остеоартрита (KOOS) улучшились с 47,1 до 93,3 (P < 0.0005). У двух пациентов, согласившихся на биопсию через 12 месяцев после операции, было обнаружено, что клетки равномерно распределены и положительно окрашиваются на коллаген II, но отрицательно окрашиваются на коллаген I по всей толщине биоптата, что указывает на высокое качество регенерированного хряща. Другое исследование подтвердило эффективность такого одноэтапного восстановления дефектов таранного хряща в 48 случаях. После имплантации средний показатель Американского общества ортопедов по стопе и голеностопу (AOFAS) неуклонно повышался: с 64,4 до 83,3 через 6 месяцев, 88,9 через 12 месяцев и 91,4 через 24 месяца. Из 48 пациентов 45 (94%) смогли заниматься спортом с низкой нагрузкой в среднем через 4,4 месяца, а 37 (77%) смогли заниматься спортом с высокой нагрузкой в среднем через 11,3 месяца.

Учитывая низкие механические свойства геля PRP, Сиклари и его коллеги использовали каркасы из полигликолевой кислоты и гиалуроновой кислоты, погруженные в аутологичную P-PRP, для заполнения дефектов коленного хряща. Через 9 месяцев у 52 пациентов улучшились все показатели KOOS, включая боль, симптомы, повседневную активность, спорт и отдых, а также качество жизни (P < 0,001). Гистологическое исследование, проведенное у пяти пациентов, показало однородную гиалиноподобную ткань, восстанавливающую хрящ.

Ни в одном из описанных выше исследований не было отмечено осложнений, связанных с PRP, в ходе последующего наблюдения.

Дегенеративные заболевания суставов

Серия случаев IV уровня

Среди отчетов о клинических случаях Ван-Саэгуса и его коллеги сообщили о самой большой серии клинических случаев остеоартрита коленного сустава, при котором применялись внутрисуставные инъекции P-PRP. В общей сложности было пролечено 808 пациентов, и 261 из них прошли оценку после строгого соблюдения критериев включения и исключения. По истечении 6 месяцев боль значительно уменьшилась, а функция коленного сустава и качество жизни улучшились без каких-либо побочных эффектов. Авторы пришли к выводу, что инъекции P-PRP оказывают локальное, эффективное и временное воздействие, уменьшая боль и восстанавливая функции. Однако отсутствие контрольной группы плацебо или консервативного лечения ставит под сомнение выводы этих исследований.

Ретроспективные сравнительные исследования уровня III

В ретроспективной выборке из 30 пациентов, страдающих от хронической боли в колене, эффективность инъекций PRP сравнивалась с более распространенным и хорошо зарекомендовавшим себя лечением гиалуроновой кислотой. Пациенты получали три внутрисуставные инъекции инактивированной PRP или гиалуроновой кислоты каждые 3 недели, и за ними наблюдали в течение 6 месяцев после последней инъекции. В обеих группах наблюдалось значительное улучшение по индексу IKDC, индексу остеоартрита университетов Западного Онтарио и Макмастера (WOMAC) и индексу Лекена, но у пациентов, получавших PRP, результаты через 6 месяцев были лучше, чем у пациентов, получавших гиалуроновую кислоту. Санчес и его коллеги сообщили о подобном когортном исследовании, в котором сравнивали терапевтический эффект P-PRP и гиалуроновой кислоты при лечении остеоартрита коленного сустава. В каждую группу вошли по 30 пациентов, подобранных по возрасту, полу, индексу массы тела и степени остеоартрита по результатам рентгенографии. Результаты считались успешными только в том случае, если показатели боли по шкале WOMAC снизились как минимум на 40% по сравнению с исходным уровнем. В группе PRP частота успешных процедур достигла 33,4% через 5 недель по сравнению с 10% в группе гиалуроновой кислоты (P = 0,004). Кроме того, по сравнению с лечением гиалуроновой кислотой инъекции P-PRP значительно снизили показатели физической активности и общий показатель WOMAC (P = 0,043, P = 0,010 соответственно) в пользу лечения PRP.

Проспективные сравнительные исследования уровня II или рандомизированные контролируемые исследования меньшего качества

Два недавних проспективных когортных исследования дополнительно подтвердили превосходство PRP над инъекциями гиалуроновой кислоты при лечении остеоартрита коленного сустава. Спакова и коллеги сообщили о 120 пациентах с остеоартритом коленного сустава, которым случайным образом вводили три инъекции L-PRP или гиалуроновой кислоты, по одной в неделю. Через 3 и 6 месяцев наблюдения в группе L-PRP были получены лучшие результаты по шкале WOMAC и числовой рейтинговой шкале (P < 0,01). В другом исследовании приняли участие 150 пациентов с дегенеративными поражениями коленного хряща, которых разделили на три равные группы. Эти три однородные группы получили по три внутрисуставные инъекции двойной PRP, низкомолекулярной гиалуроновой кислоты или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты. При наблюдении в течение 6 месяцев наилучшие результаты по шкале IKDC, визуальной аналоговой шкале и удовлетворенности пациентов были достигнуты в группе PRP (P < 0,005), особенно у молодых пациентов с повреждениями хряща или ранним остеоартритом.

В рандомизированном контролируемом исследовании, в котором сравнивалось лечение P-PRP и гиалуроновой кислотой у 32 пациентов с остеохондрозом таранной кости, средний балл по шкале AOFAS значительно улучшился с 68 и 66 до 92 и 78 через 28 недель в группах P-PRP и гиалуроновой кислоты (P < 0,0001) соответственно, в пользу лечения P-PRP (P < 0,05). В группе P-PRP также были отмечены более высокие результаты по визуальной аналоговой шкале и другим субъективным показателям (P < 0,01).

Высококачественные рандомизированные контролируемые исследования уровня I

В недавнем РКИ сравнивали PRP с плацебо для лечения ОА коленного сустава. Семьдесят восемь пациентов (156 коленных суставов) были случайным образом разделены на три группы. Группа А получила однократную инъекцию P-PRP, группа В получила две инъекции P-PRP с интервалом в 3 недели, а группа С получила однократную инфильтрацию физиологическим раствором. Через 6 месяцев все показатели по шкале WOMAC улучшились в группах A и B, но ухудшились в группе C. Эти результаты подтверждают краткосрочную эффективность инъекций P-PRP по сравнению с плацебо в облегчении боли и улучшении функции коленного сустава.

Эффективность PRP при лечении остеоартрита также сравнивалась с введением гиалуроновой кислоты. Серза и его коллеги сообщили о 120 пациентах с гонартрозом, которым было проведено 4 рандомизированных внутрисуставных инъекции P-PRP или гиалуроновой кислоты. Пациенты в двух группах были сопоставимы по возрасту, полу, тяжести остеоартрита коленного сустава и показателям WOMAC до лечения. У всех пациентов показатели WOMAC оценивались до инъекции и через 4, 12 и 24 недели после первой инъекции. В то время как показатели WOMAC после лечения в обеих группах значительно улучшились по сравнению с показателями до инъекции, улучшение было более значительным в группе, получавшей P-PRP, чем в группе, получавшей гиалуроновую кислоту, в каждый из периодов наблюдения. Кроме того, тенденция сохранялась в течение 24 недель наблюдения в группе, получавшей P-PRP, но начала ослабевать через 4 недели в группе, получавшей гиалуроновую кислоту. Эти результаты показали, что P-PRP оказывает более сильное и продолжительное воздействие на ослабление симптомов остеоартрита по сравнению с гиалуроновой кислотой. В многоцентровом двойном слепом рандомизированном исследовании 176 пациентов с симптоматическим остеоартритом коленного сустава были случайным образом распределены в группы, получавшие инъекции P-PRP или гиалуроновой кислоты. Группы были хорошо сбалансированы по возрасту, полу, индексу массы тела, проценту пациентов с первичным артритом, ежедневному потреблению анальгетиков, рентгенологической стадии, а также по шкалам WOMAC и Лекена. Основным показателем эффективности было снижение боли в колене на 50% по сравнению с исходным уровнем к 24-й неделе; согласно этому показателю, частота ответа была на 14,1% выше у пациентов, получавших P-PRP, по сравнению с группой, получавшей ГК. Что касается вторичных показателей, оценивающих боль, скованность и физическую активность, PRP также показала лучшие результаты, чем гиалуроновая кислота, хотя и не достигла статистической значимости. Другое недавнее РКИ подтвердило превосходство P-PRP над гиалуроновой кислотой в облегчении боли и скованности в колене, а также в улучшении физической активности через 24 и 48 недель.

С другой стороны, одноцентровое двойное слепое рандомизированное контролируемое исследование, в котором приняли участие 109 пациентов, показало, что лечение PRP не привело к статистически значимым различиям по всем показателям, оцениваемым в сравнении с инъекциями гиалуроновой кислоты, через 12 месяцев после лечения. Дальнейший анализ показал тенденцию в пользу PRP у пациентов с менее выраженными дегенеративными изменениями суставов через 6 и 12 месяцев, хотя статистически значимых различий выявлено не было (P = 0,08 и P = 0,07 соответственно). Однако, в отличие от вышеупомянутых РКИ, в которых использовался свежий P-PRP, в этом исследовании PRP готовился вручную путем двойного центрифугирования с последующим замораживанием и оттаиванием. Хотя точная концентрация лейкоцитов не сообщалась, было подсчитано, что этот препарат концентрировал лейкоциты вместе с тромбоцитами, и конечный продукт, вероятно, содержал гораздо более высокий уровень провоспалительных сигнальных цитокинов, чем P-PRP.

Неблагоприятное воздействие концентрированных лейкоцитов в PRP также отражается на реакциях после инъекции. После внутрисуставных инъекций P-PRP наблюдались невыявляемые или слабовыраженные побочные эффекты, которые проходили самостоятельно, что сопоставимо с побочными эффектами, наблюдаемыми при введении гиалуроновой кислоты, но PRP, полученный методом двойного центрифугирования, вызывал значительно более выраженную болевую реакцию, чем гиалуроновая кислота (P = 0,039). РКИ, в котором сравнивались одно- и двухкомпонентные PRP, подтвердило, что последние вызывают более сильную боль и отечность, чем первые, в которых концентрация лейкоцитов была ниже.

Заключение

Результаты исследований, полученные в ходе фундаментальных и доклинических исследований, а также клинических испытаний, в совокупности свидетельствуют о том, что PRP является многообещающим средством для лечения повреждений хрящевой ткани и облегчения симптомов благодаря трем известным биологическим свойствам. Во-первых, PRP оказывает анаболическое действие на хондроциты, МСК и синовиоциты, что приводит к увеличению пролиферации клеток, накоплению хрящевого внеклеточного матрикса и секреции гиалуроновой кислоты. Во-вторых, PRP может действовать как биоактивный клеточный каркас для заполнения дефектов и усиления регенерации хрящевой ткани. В-третьих, PRP обладает потенциалом подавлять воспаление и облегчать симптомы остеоартрита с клинически приемлемым профилем безопасности. Несмотря на то, что большинство опубликованных исследований отдают предпочтение PRP, а не гиалуроновой кислоте, для лечения остеоартрита, терапия PRP остается непредсказуемой из-за значительной неоднородности исследований и различий в препаратах PRP. Будущие исследования имеют решающее значение для выяснения функциональной взаимосвязи между конкретными компонентами PRP и основными патогенетическими механизмами.

Сокращения

• AOFAS: Американское общество ортопедов стопы и голеностопного сустава
• BMSC: Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга
• Col: Коллаген
• ECM: Внеклеточный матрикс
• FBS: Фетальная бычья сыворотка
• HA: Гиалуроновая кислота
• HGF: Фактор роста гепатоцитов
• IGF: Инсулиноподобный фактор роста
• IKDC: Международный комитет по документации коленного сустава
• IL: Интерлейкин
• IL-1ra: Антагонист рецептора IL-1
• KOOS: Оценка результатов травмы колена и остеоартрита
• L-PRF: Фибрин, богатый лейкоцитами и тромбоцитами
• L-PRP: Плазма, богатая лейкоцитами и тромбоцитами
• MMP: Матриксная металлопротеиназа
• МРТ: Магнитно-резонансная томография
• Магистр: Мезенхимальные стволовые клетки
• NF-kB: Ядерный фактор каппа B
• ОА: Остеоартрит
• PDGF: Фактор роста, полученный из тромбоцитов
• PLGA: Поли (молочно-ко-гликолевая кислота)
• P-PRP: Чистая плазма, богатая тромбоцитами
• PBS: Физиологический раствор с фосфатным буфером
• PPP: Бедная тромбоцитами плазма
• PRF: Богатый тромбоцитами фибрин
• PRP: Богатая тромбоцитами плазма
• PRPr: Высвобождение PRP
• РКИ: Рандомизированное контрольное исследование
• sTNF-R: Растворимый рецептор TNF
• TNF: Фактор некроза опухоли
• VEGF: Фактор роста эндотелия сосудов
• WOMAC: Индекс остеоартрита Университетов Западного Онтарио и Макмастера.